前言
利用免疫途径治疗癌症的免疫疗法正在迅速成为继手术、化疗和放疗之后的一种公认的癌症治疗方法。
免疫治疗策略包括基于抗体的“检查点”抑制、过继T细胞治疗和治疗性疫苗接种。利用针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA－4）、程序性死亡受体1（PD－1）或程序性死亡配体1（PD－L1）的单克隆抗体（mAb）进行检查点阻断，在癌症免疫治疗方面取得了显著突破。
尽管免疫疗法有其优点，但它只在一小部分患者中获得成功，而广泛预测其疗效的生物标志物仍有待确定。对癌症的免疫反应通常受到三个主要瓶颈的限制：（i）肿瘤细胞是“非自我”的识别，（ii）外周免疫耐受，以及（iii）肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制。免疫治疗本身，或与其他策略相结合，最好能克服这些瓶颈。到目前为止，已经对各种联合治疗进行了试验，但由于缺乏协同作用或出现不可接受的毒性反应而效果有限。
在这里，小分子疗法的使用可能被证明是有帮助的，因为这类药物相比单抗有许多优点。特别是，较短半衰期的小分子有利于急性和可逆的作用，并可能减少持久的全身副作用。与抗体不同的是，小分子通常以细胞内蛋白质为靶点，并具有不同的毒性特征，使其成为适用联合治疗的候选者。此外，与抗体相比，它们可以以更低的成本生产，并且通常可以口服给药。因此，需要基于免疫学和肿瘤学过程的分子洞察力的新策略来提高小分子在免疫治疗中的潜力，重点是小分子有望提高检查点阻断对癌症的成功率。
靶向PD－1和PD－L1的小分子药物
PD－1／PD－L1功能轴抑制TCR和CD28信号传导，从而限制肿瘤特异性T细胞的最佳启动及其抗肿瘤活性。目前，该功能轴主要被抗体靶向；然而，小分子PD－1／PD－L1拮抗剂可能有助于降低毒性。其中一些似乎通过一种新的二聚体锁定机制起作用（如BMS－103、－142、－200、－202、－242、－1001和－1166），在体外具有很好的效果。另一种用于PD－L1、PD－L2和VISTA的小分子拮抗剂（CA－170）目前正在对晚期实体瘤和淋巴瘤患者（300名受试者）的1期剂量爬坡试验（NCT02812875）中进行评估。然而，靶向PD－1／PD－L1通路的小分子的开发落后于单抗，这是由于PD－1／PD－L1界面的疏水性，设计高亲和力的小分子阻断剂非常具有挑战性。
治疗性疫苗
治疗性疫苗旨在诱导肿瘤特异性CD8＋T细胞产生CTL反应。为了获得最佳的CTL启动，需要CD4＋T细胞的帮助。因此，治疗性疫苗包括CD4＋和CD8＋T细胞的特异性抗原，以及激活DC细胞的化合物。主要的策略是使用合成的长肽（SLP）（长度约为20－40个氨基酸）或抗原编码的mRNA或DNA，包括MHCI和MHCII表位，以确保CD8＋CTL启动和CD4＋T细胞的辅助，从而获得强劲的CTL反应。这些疫苗在治疗早期病毒性癌症方面显示出一定的治疗前景。此外，最近正在进行的Ib期随机胶质母细胞瘤试验（NCT02287428）表明，根据单细胞TCR分析，接种多表位、个性化新抗原可成功诱导肿瘤内新抗原特异性CD4＋和CD8＋T细胞免疫应答。然而，参与研究的所有患者最终都复发了，这表明肿瘤相关的免疫抑制和其他挑战是一个重要的、持续的瓶颈。
靶向Toll样受体的小分子药物
FDA批准的第一种治疗基底细胞癌的小分子免疫肿瘤学药物是Imiquimod，一种咪唑啉衍生物，常用于治疗生殖器疣。
Imiquimod靶向toll样受体7（TLR7），一种结合保守PAMPs的模式识别受体（PRR），如双链RNA、脂多糖或未甲基化CpG－DNA。大多数TLR表达在细胞表面，但TLR3、7、8和9主要位于内涵体。小分子TLR8激动剂motolimod（VTX－2337）通过刺激自然杀伤细胞（NK）和增强抗体依赖性细胞介导的毒性，在复发或转移性头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中表现出抗肿瘤活性。
Motolimod联合西妥昔单抗（一种抗EGFR抗体）或常规化疗，导致TME中Tregs数量减少，循环EGFR特异性CD8＋T细胞数量增加，与西妥昔单抗或化疗相比，无进展生存率（PFS）和总生存率增加。
Imiquimod、motolimod和resiquimod（靶向TLR7和TLR8）目前正在进行一系列临床试验（NCT03276832、NCT0397626、NCT02126579、NCT01204684）用于实体瘤的治疗，通常作为疫苗接种的佐剂。因此，针对其他TLR的小分子的研究仍在继续，通常在基于细胞的分析中使用药物库的高通量筛选。其他PRR，如NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLRs）或RIG－I样受体（RLRs）的研究较少，但针对这些家族的激动剂可能增强免疫反应性，目前正在开发中。
靶向cGAS／STING的小分子药物
STING是内质网膜上的一种PRR，它与cGAS转化的细胞质DNA中的环状二核苷酸结合。cGAS／STING通路的激活导致了I型IFN的产生，它促进了DC的激活和T细胞的启动。荷瘤小鼠动物实验的结果提示STING可能是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点。STING信号途径由外核苷酸焦磷酸酶／磷酸二酯酶－1（ENPP1）调节，后者水解cGAMP，从而控制信号级联的激活。
因此，人们尝试通过抑制ENPP1激活STING通路。然而，有其他研究报告，cGAS／STING信号可诱导吲哚胺－2，3－双加氧酶（IDO1；一种色氨酸分解代谢酶，可诱导免疫抑制和免疫逃避），并抑制同源介导的DNA修复，从而抑制Lewis肺癌小鼠模型的免疫反应并促进肿瘤生长。这些研究表明，在我们充分了解STING激动剂治疗的效果之前，还需要更多的研究证明cGAS／STING通路在肿瘤免疫中的作用。
标准护理治疗的免疫原性能力
放化疗可直接杀伤肿瘤细胞，但也可增强抗肿瘤免疫。目前流行的观点是，这些治疗可能导致免疫原性细胞死亡，其特征是释放肿瘤抗原和危险信号（如胞浆DNA），这些信号能够通过PRR激活DC，如TLRs和cGAS／STING。当护理治疗的标准遵循免疫治疗时，临床前动物模型中报告了显著的效果。
目前，根据三期KEYNOTE－189临床试验（NCT02578680）的结果，FDA批准将pembrolizumab（抗PD－1单克隆抗体）与顺铂和培美曲塞联合应用作为转移性非小细胞肺癌（NSCLC）的一线治疗方法。
此外，蒽环类药物（如阿霉素）可在纤维肉瘤小鼠模型中诱导I型干扰素的产生，并在小鼠乳腺癌模型中选择性地消耗免疫抑制性髓源性抑制细胞（MDSC），从而抑制体内肿瘤的进展。最近的II期单中心张力试验（NCT02499367）表明，与单用抗PD－1相比，顺铂（ORR 23％）或阿霉素（ORR 35％）与nivolumab（抗PD－1单抗）联合使用可改善三阴性乳腺癌（TNBC）患者的治疗效果。
同样地，atezolizumab（anti－PD－L1单抗）与紫杉醇（一种通过稳定微管阻断有丝分裂的化疗药物）联合使用，现已被FDA批准用于治疗局部晚期或转移性TNBC。这是基于III期IMpassion130试验（NCT02425891）的结果，显示联合治疗的PFS优于单纯化疗。
增强检查点抑制剂效果的其他化疗药物目前在临床试验中的包括：环磷酰胺；铂类药物，如奥沙利铂；和PARP抑制剂olaparib（NCT02484404；NCT02634），talazoparib（NCT03964532；NCT03330405），rucaparib（NCT03639935）和veliparib。
此外，各种细胞周期蛋白依赖激酶4和6抑制剂（CDK4／6i），包括palbociclib和abemaciclib，以及抗雄激素药物恩扎鲁他胺、比卡鲁胺（NCT03650894）、GTX－024（NCT02971761）和fulvestrant（NCT03280563）。
靶向IDO1的小分子药物
小分子药物也可用于特异性靶向抑制因子，诱导或恢复TME的免疫反应性，一个这样的TME靶标包括IDO1。IDO1／kynurenine的免疫抑制作用包括Treg细胞的扩增和MDSCs的募集。IDO1剥夺了CTL激活所需的色氨酸，并通过PD－1表达对抗CD8＋T细胞效应器功能。
Indoximod是第一个在人类身上测试的IDO1抑制剂，但结果令人困惑，因为这种化合物实际上可能抑制了IDO1的下游效应器mTORC1。
Epacadostat是一种特异性更强的IDO1抑制剂，与pembrolizumab（抗PD－1单克隆抗体）联合使用，在I／II期ECHO－202／KEYNOTE－037试验（NCT02178722）中对多发性晚期实体瘤患者显示了良好的结果，但在黑色素瘤患者的III期临床试验（NCT02752074）中并未增加抗PD－1的疗效。
同样，在I／II期ECHO－203试验（NCT02318277）中，Epacadostat与抗PD－L1单克隆抗体耐受性良好，但在这些患者中没有联合效应。因此，多家制药公司已经停止或正在缩减IDO1抑制剂的开发，这大大减少了此类小分子的早期临床开发。
靶向前列腺素通路的小分子药物
IDO1表达的驱动因素之一是环氧合酶2（COX－2），它是肿瘤免疫治疗中未被充分研究的靶点，但也是非甾体抗炎药（NSAIDs）的常见靶点。COX－2催化前列腺素的合成，一种参与对损伤和炎症反应的脂质化合物。这种酶在几种癌症中表达，因此，celecoxib（一种能抑制COX－2和IDO1的非甾体抗炎药）正被用于癌症治疗。
一项研究开发了celecoxib的类似物，在体外对黑色素瘤和结肠癌细胞系具有强大的细胞抑制作用。COX－2和EGFR同时抑制在体外对NSCLC细胞系的细胞增殖和凋亡有协同作用。在Lewis肺癌小鼠模型中，melafolone（一种天然存在的类黄酮）对COX－2和EGFR的双重抑制作用，可以通过血管正常化和PD－L1下调来改善PD－1阻断作用。这些研究证明了联合疗法同时针对多个肿瘤相关分子的潜力。
COX－2信号通路的下游是G蛋白偶联受体EP2和EP4，它们与前列腺素E2（PGE2）结合。前列腺素通过EP2和／或EP4通路发出信号，通过阻断DC活性、将DC分化方向重新定向到抑制表型和抑制巨噬细胞，在建立免疫抑制环境中具有重要意义。
因此，人们针对这些受体的小分子拮抗剂的兴趣不断增加，各种EP2和EP4拮抗剂正在开发中（例如，AH6809、AH23848、TG6－129、TG4－155、PF－04418948、RQ－07和RQ－15986）。EP2和EP4的双重抑制与检查点抑制剂的联合应用表明，在体外上皮性卵巢癌中，肿瘤源性CTL增加了抗原特异性促炎性细胞因子的产生。因此，在TME中控制前列腺素的信号可能会提高抗肿瘤免疫，尽管广泛的测试显然是有必要的。
靶向精氨酸代谢的小分子药物
精氨酸酶是TME的另一个潜在治疗靶点。这种普遍存在的含锰酶将L－精氨酸催化水解为L－鸟氨酸和尿素，并在炎症的各个方面发挥重要作用。精氨酸酶在哺乳动物有两种亚型：主要在肝脏中的细胞质精氨酸酶Ⅰ（ARGⅠ）和线粒体基质中的精氨酸酶Ⅱ（ARGⅡ）。
在TME中，MDSCs和TAMs可向细胞外空间释放大量的ARGⅠ，以局部消耗精氨酸浓度，从而损害TCR信号的传导和增殖。在T细胞共培养中，ARG I抑制剂CB－1158（INCB001158）阻断了骨髓细胞介导的T细胞增殖免疫抑制，降低了不同小鼠模型的肿瘤生长。
此外，与对照组相比，CB－1158治疗组小鼠TME中IFN诱导基因表达增加，炎性细胞因子表达增加，肿瘤浸润性NK细胞和CD8＋T细胞增多。目前，该药物作为单一药物以及与抗PD－1单克隆抗体和小分子抑制剂联合用于晚期／转移性实体瘤的两个早期临床试验（NCT02903914；NCT03910530）正在进行中。
另一种在MDSCs和TAMs中大量表达的酶是一氧化氮合成酶（iNOS）。iNOS将L－精氨酸水解为一氧化氮（NO），一氧化氮随后通过干扰JAK3－STAT5信号通路抑制T细胞功能。当ARG－I被抑制时，iNOS有更多的底物产生NO，而导致免疫抑制。为了克服这一点，最近开发了双ARG I／iNOS抑制剂，如NCX4016和TA38，并将在不久的将来进行测试。
靶向TME中的Treg
Tregs可以表达胞外核苷酸酶CD39和CD73；通过ATP的去磷酸化产生腺苷的膜分子。腺苷随后可与常规T细胞表面的A2A或A2B受体结合，并在黑色素瘤小鼠模型中发现抑制CD8＋T细胞浸润。腺苷也能与Tregs上的A2A受体结合，导致Treg群体的扩大，以增强其体外免疫抑制作用。为了减轻Treg介导的TME抑制，已经开发出小分子A2A拮抗剂，如CPI－444、AZD4635、vipadenant、preladenant（SCH－420815，MK3814，MSD）和PBF－509。
这些化合物目前正在进行I期和II期临床试验，单独或与抗PD－1或抗PD－L1抑制剂联合用于各种实体瘤（NCT02740985、NCT0408953、NCT02655822、NCT03454451和NCT02403193）。
另一个Treg靶点是维甲酸受体相关孤儿受体γ（RORγt），一种参与T细胞促炎IL－17途径的转录因子。RORγt激动剂可诱导细胞因子和趋化因子的产生，降低Tregs的增殖，并逆转肿瘤细胞的免疫抑制作用。
合成小分子RORγt激动剂促进Th17（CD4＋）和Tc17（CD8＋）细胞的活性、增殖和存活，并在过继T细胞治疗小鼠模型中增强Th17效应器功能。两个II期临床试验正在测试这些激动剂的效果，一个作为单一药物评估安全性和耐受性（NCT02929862），另一个评估单独或与抗PD－1单抗联合治疗NSCLC的安全性／耐受性（NCT03396497）。
这些试验的结果很难预测，因为Th17细胞在许多癌症类型中与预后不良有关。在这些情况下，RORγt拮抗剂可能提供治疗益处。然而，由于RORγt有一个大的亲脂配体结合域，抑制剂的设计非常复杂。此外，刺激RORγt可促进自身免疫性疾病，如炎症性肠病。因此，考虑到“经典”检查点抑制剂anti－CTLA－4和anti－PD－1抗体也可以诱导自身免疫，因此有必要提醒，这种类型的组合可能会导致强烈的副作用。
靶向趋化因子受体的小分子药物
趋化因子及其受体的功能引导肿瘤细胞迁移到转移部位，将免疫细胞导向特定组织。趋化因子受体CXCR4在癌细胞中经常被激活，并参与上皮－间充质细胞转化、侵袭、转移和肿瘤血管化。一系列趋化因子受体的小分子拮抗剂已经被开发出来，其中最著名的一种，plerixafor（AMD3100）已经报道了对急性淋巴细胞白血病和复发急性髓性白血病的疗效。在小细胞肺癌异种移植小鼠模型中，plerixafor联合化疗可减少原发性肿瘤生长并抑制转移。
plerixafor对CXCR4的抑制作用抵消了TME中依赖于CXCL12的PD－L1上调以及免疫抑制的Tregs和M2巨噬细胞的募集。这项研究使用肝细胞癌小鼠模型显示，与对照组相比，CXCR4抑制与抗PD－1单抗和索拉非尼联合抑制肿瘤生长，减少肺转移，并提高动物存活率。趋化因子受体CXCR2在各种癌症中过表达，与人类胰腺导管腺癌患者的不良预后相关。
在胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌小鼠模型中，CXCR2抑制可阻止骨髓间充质干细胞进入TME，因此有人建议将其用于增加肿瘤对免疫治疗的敏感性。目前，一项I／II期非随机试验正在招募黑色素瘤患者，以测试双重CXCR1／2抑制剂SX－682作为单一药物或与抗PD－1单克隆抗体联合使用的安全性和有效性（NCT03161431）。其他靶向小分子的趋化因子受体正在临床前和临床试验中作为单一药物或结合检查点阻断剂进行评估。
这些包括CXCR2拮抗剂AZD5069（NCT02583477）、CXCR4抑制剂X4P－001（NCT02923531）、CCR2抑制剂PF－413609、CCR5抑制剂maraviroc（NCT03274804）、CCR2／5拮抗剂BMS－813160（NCT03496662）、（NCT03184870）和CCR4抑制剂FLX475（NCT03674567）。
展望
肿瘤免疫治疗的领域正在爆炸式发展，小分子对免疫反应的定向和特异性调控的新阶段正在形成。有许多令人兴奋的进展，很可能在不久的将来，新的小分子将与抗PD－1／PD－L1或抗CTLA4阻断的单抗结合使用。通过蛋白质降解靶向嵌合体（PROTACs）技术诱导特异性蛋白质降解的新治疗策略，将使小分子潜在靶点的数量显著增加，将大大扩展操纵免疫反应的选择。这些新技术，连同其他新的药物开发，有望进一步扩大未来癌症治疗的方法库。
在免疫治疗中靶向PD－1／PD－L1和CTLA－4信号通路可以诱导多种癌症患者产生有效的抗肿瘤CTL反应。然而，只有部分患者有反应，可用的治疗组合通常与严重不良事件相一致。因此，在降低毒性的同时，新的治疗方案对于进一步提高肿瘤免疫治疗的疗效至关重要。而小分子药物为提高治疗成功率提供了机会。与大多数抗体相比，小分子很容易渗透到组织中，因此可以直接作用于细胞外和细胞内靶点，以提高抗肿瘤免疫。
此外，他们的半衰期通常很短，降低了他们发生不良反应的机会。由于这些特点，在癌症免疫治疗领域开发基于小分子的策略引起了广泛的兴趣。而如何根据已知的分子机制合理地选择化疗－免疫治疗组合是这方面持久的挑战。此外，重点应放在优化这些联合治疗的剂量和时间，以最大限度地发挥协同作用。化学免疫治疗有许多靶点需要评估，而只有很少的组合已经被评估，或者目前正在测试中。因此，化学免疫治疗的未来仍然广阔而令人兴奋。
参考文献：
1． Opportunities for Small Molecules in Cancer Immunotherapy． Trends Immunol． 2020 Jun；41（6）：493－511．
