哪些细菌可以存活？

近年来，随着核酸测序技术的重大进步，将肠道菌群不仅与肠道疾病（例如炎症性肠病）联系起来的研究已显着增加或结直肠癌，但也涉及其他广泛的医学疾病，包括代谢紊乱甚至精神健康疾病。这导致了这样的假说，即通过粪菌移植对肠道微生物群的修饰可能在多种疾病中具有治疗作用。

粪菌移植是一种治疗性干预措施，其中将来自一个或多个健康供体的粪便处理成粪便浆液（FS），然后输送到接受者的肠道中。虽然粪菌移植最好是作为复发的疗法建立艰难梭菌感染，提供了用于炎性病症的用途粪菌移植的，尤其是溃疡性结肠炎。关注公众号：肠道微生态研究院

尽管其用途越来越广泛，但既没有标准化的供体筛查也没有标准化的粪便处理。这种标准化的缺乏延伸到临床试验，其中有超过200个注册的使用粪菌移植的，使得结果难以比较。令人担忧的是，粪菌移植还经常在私家诊所进行，甚至由患者本人进行，以证实未经证实的适应症和完全不受管制的方式。

当前的粪菌移植粪便处理指南旨在治疗艰难梭菌结肠炎，并且基于缺乏证据的专家意见。通过在间隙粪菌移植结果的确切机制艰难梭菌在粪便处理协议从粪便不是已知的，和变化似乎对粪菌移植的功效用于该适应症影响不大。这导致设计用于艰难梭菌的方案在使用粪菌移植作为其他适应症的试验中采用了感染，其作用机制可能不同。尽管已知暴露于氧气会导致许多专性厌氧细菌感染迅速死亡，但这些方案通常涉及使周围空气中的粪便均匀化。

目前，几乎没有证据可指导临床医生选择粪便处理方法。通常不尝试对已加工的粪菌移植供体材料中的微生物组组成进行表征，并且在进行该操作时，通常需要对提取的粪便DNA进行高通量测序。这种方法将检测源自有活力和无活力生物体的DNA，因此，指示哪些细菌具有活力并能够在受体中复制的能力有限。培养方法仅能分离出总肠道菌群的一小部分，因此不适合表征加工过程对许多常见厌氧菌的影响。

克服这些挑战的策略是将分子技术（如下一代测序和靶向定量PCR分析）与单叠氮化丙啶样品处理（PMA－qPCR）结合使用。PMA是一种红色荧光染料，可选择性进入细胞膜受损的细胞。暴露于光下，PMA将与这些细胞中的DNA共价结合，从而抑制PCR扩增。这样，样品材料的PMA处理允许仅从样品中的活细胞中选择性扩增DNA 。在这项研究中应用的PMA－qPCR方法经过特别优化，可用于粪便中进行移植，并与培养方法进行了比较。

我们报告厌氧均质化，有氧均质化和冻融对粪便微生物群处理的供体粪便中细菌的活力和功能能力的影响。

粪菌移植粪便（FS）处理

从粪便中收集粪便作为粪菌移植供体进行临床试验。所有捐助者都通过了筛选调查表，用于确定潜在的粪菌移植捐助者。在现场收集粪便，并在15分钟内进行处理。将凳子分成两等份，重至少30 g。将每个等分试样（在240 V Waring SS515实验室混合器中以22，000 rpm的速度）与生理盐水（NS）和甘油混合，以产生由25％（wt ／ vol）粪便，65％NS和10％粪便组成的粪便浆液（FS）。如前所述甘油。在第一等份（ANO 2粪便混合和PMA处理在厌氧室内的厌氧条件下进行。在第二等分试样中，在环境空气中执行相同的步骤。将所得的FS在－80 o C的50 mL离心管中冷冻。为了评估冻融的效果，将厌氧处理过的FS的50 mL等分试样在－80 o C下储存？48 h，然后在室温下于厌氧室内融化。在处理或PMA处理期间，冻融的样品未暴露于氧气。热杀伤通过使解冻FS的1毫升等分至99进行℃30分钟。

新鲜，冷冻，解冻和热灭活的FS的稀释和PMA处理

紧接上述过程之后，将纯净的FS（粪便含量的25％）在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释100倍，并在无RNase的1．5 mL透明试管中分成6个95μL等分试样美国马萨诸塞州）。如上所述，在有和没有PMA的情况下，一式三份处理稀释的样品。将样品保存在－80提取之前℃。PMA处理是使用专门开发的协议进行的，并已针对粪便进行了验证。通过将1 mg PMA（Biotium Inc．，Fremont，CA，USA）溶解在1 mL 20％二甲基亚砜中来制备PMA储备液。对于PMA处理，将5μLPMA储备液添加到95μL样品中以达到100μMPMA终浓度。在室温下于黑暗中孵育30分钟后，将样品暴露于LED灯（Aqua Zonic，新加坡）中20分钟。在未经PMA处理的对照等分试样中，添加5μLPBS代替PMA。对照样品与匹配的PMA处理的样品进行相同的孵育和曝光。

微生物组成的测定

从整个（100μL）未纺样品中提取DNA。根据制造商的说明，使用PowerLyzer PowerSoil DNA分离试剂盒（MO BIO实验室，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）提取DNA，并保存在－20o C下。
通过对细菌16S rRNA基因的V4高变区进行配对末端测序，确定粪便样本的微生物组成。如前所述，在Illumina MiSeq平台上进行了扩增子测序。配对末端读段使用先前描述的生物信息学流水线［合并，解复用，并使用到微生物生态学（QIIME）软件（v1．9．1的）定量数据分析进行分析。使用针对97％相似度聚类的SILVA 16S rRNA参考数据库（版本128）的开放参考方法，将序列分配给操作分类单位（OTU）。对所有样本进行二次采样，深度达到6188个序列读数。使用QIIME计算用于确定分类单元丰富度（观察物种）和多样性（PD整棵树）的alpha多样性指标。

将所有样本中零计数的分类单元归一化为单一计数。通过计算相对于所有分类群中厌氧处理的匹配对照的相对丰度倍数变化的log2值，确定分类群相对丰度的变化。根据log2倍变化总和的反对数除以检测到分类单元的供体数，计算出分类群相对丰度平均倍数变化。分析中仅包括每个供体中至少一个对照组中存在的细菌类群（序列计数≥2），并且在8个供体中至少7个中存在。

物种特异性细菌计数

总细菌水平，丁酰－CoA：乙酸CoA－转移酶基因，厌食厌氧杆菌，普氏杆菌，哈里氏杆菌，罗斯伯氏菌／真细菌，双歧杆菌。Alistipes putredinis和Bacteriodes spp。使用QuantStudio 6实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），使用先前描述的qPCR测定法（在补充表1中详述）测定DNA。该Subdoligranulum变量qPCR分析是作为这项研究的一部分（见补充方法）。大肠杆菌使用基于探针的测定法，使用KAPPA PROBE FAST ROX Low Master Mix试剂（南非开普敦，Kapa Biosystems）扩增DNA。使用SYBR绿色荧光试剂（PowerUp SYBR Green Master Mix，Applied Biosystems）进行所有其他PCR测定。定量PCR测定法为丁酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶基因，苛养菌，包括A． hadrus，霍氏真杆菌，罗斯氏／ E。直肠和S．变量，从供体粪便中提取的DNA的10倍稀释系列用作阳性qPCR标准。

通过将在PMA存在下扩增的细胞数量除以在匹配的未处理对照中扩增的细胞数量来确定每个样品中存活的细菌细胞的比例。为了确定在热灭活的标本中可行的比例，将在经过PMA处理的热灭活的样品中扩增的细胞数量除以在热灭活之前的对照样品中扩增的细胞数量。热灭活的标本用作阴性对照，代表在不可行标本中预期的扩增水平。

代谢组学功能评估

如前所述，我们使用体外发酵模型评估了差异处理的粪便浆料的功能能力。当与发酵底物高直链玉米玉米淀粉（HAMS）孵育时，该方法评估样品中微生物群产生SCFA的能力。简而言之，将已如前所述处理过的ANO 2或O 2的粪菌移植供体（n ＝ 8）的冷冻粪便粪便样品解冻，并在严格的厌氧条件下与HAMS一起孵育。加热杀菌的粪便浆料（n ＝ 2）和HAMS（n＝ 2）用作阴性对照。通过火焰离子化检测的气相色谱法（Hewlett－Packard6890； Palo Alto，CA，USA）测定SCFA水平。孵育前和在37°C摇动厌氧孵育24小时后，测量乙酸，丁酸和丙酸水平。使用4－甲基戊酸（Sigma－Aldrich）作为内标对结果进行标准化。使用Wilcoxon配对对的符号秩检验比较两组中的SCFA产生

统计分析

使用GraphPad Prism 7．03软件进行统计分析。显着性（p值＜0．05）使用配对t检验对参数数据进行确定，而Wilcoxon配对对有符号秩检验用于非参数数据进行确定。

供体特征

捐助者的中位年龄为28．5岁（21－41岁），男女比例相等。相同数量的捐助者具有东南亚和欧洲遗产（补充表2）。

加工方法对粪便中细菌活力的影响
立即进行厌氧处理后，FS中存活细菌的平均比例为0．50±0．24（平均值±SD）。在环境空气中处理后，该比例下降到0．19±0．07，在厌氧处理后进行一个冻融循环后，该比例为0．23±0．11。？与单独的厌氧处理相比，在环境空气中处理后（p ？＝ 0．007）和冻融后（p ＝ 0．027），观察到存活的细菌细胞比例显着降低。在所有加工方法中，活细菌的比例均大于在热灭活的标本中检测到的比例（p＞ 0．001）。

使用16S rRNA基因qPCR结合PMA处理确定为可行的细菌比例。通过将在PMA处理的样品中扩增的活细胞除以在未经PMA处理的对照样品中扩增的细胞总数，来确定活细胞的比例。在新鲜需氧条件下（ANO 2），新鲜需氧条件下（O 2），在厌氧处理过的标本中冷冻和解冻一个周期（FT1）或在热杀死后（HK），评估粪便中的细菌生存力。（条形图表示8个供体粪便样本的平均值±SD＝ p ＜0·05， ＝ p ＜0·01；成对t检验）。

微生物群的多样性

在PMA处理后，在厌氧条件下处理的标本中检测到的活类群多样性明显低于使用标准方法（无PMA）处理的标本（图2； 分类群丰富度：p ＜0．001；PD整棵树：p＝ 0．007）。与ANO 2处理（p＝ 0．023）或FT样品（p＝ 0．023）相比，在环境空气（O 2）中处理后，观察到的可行分类单元丰富度显着降低。ANO 2和FT组之间没有观察到多样性差异。O 2和ANO 2之间以及O 2和FT组之间的PD整树多样性差异不显着。

通过16S rRNA基因扩增子测序评估有无PMA处理后来自8个供体的粪便微生物群移植材料的分类单元丰富度。存活多样性（PMA处理组）显着低于对照样本中观察到的多样性，即使在厌氧条件下立即处理的样本中（＝ p ＜0·001，成对t检验）。当仅比较在厌氧条件下（ANO 2），环境空气（O 2）或在厌氧处理的样品（FT1）冷冻和融化一个周期后处理的样品之间的可行多样性时，在处理过的O 2样品中观察到的物种明显较低，而标本的冻融并没有显着降低多样性，箱形图表示中位数和IQR，误差线表示最小值到最大值；＝ p ＜0·05； Wilcoxon配对配对签署等级测试）。

可行的微生物群组成

在所有样品中显示最大相对丰度的五个分类单元（OTU）分别属于拟杆菌属，普氏杆菌属，双歧杆菌属，费氏杆菌属和漆螺菌科（平均相对丰度分别为0．21、0．09、0．05、0．05和0．05）。为了确定哪个类群受环境氧气或冻融处理的影响最大，按相对丰度倍数变化对类群进行排序。在环境空气中处理后，有19个分类单元的相对丰度下降了2．5倍或更多，而冻融组中只有2个分类单元。受环境空气处理影响最大的分类单元包括Faecalibacterium，Subdoligranulum，Eubacterium hallii，reeutale，Roseburia和Anaerostipes，它们代表了健康人类肠道微生物群中主要的丁酸酯生产分类单元。埃希氏菌－志贺氏菌和阿利斯提比斯是唯一的类群，在环境氧气或冻融条件下相对丰度增加了2．5倍或更多，并且仅在环境空气中处理后才观察到。

在环境空气中处理后（O 2对ANO 2）或在冻融后（FT1对ANO 2），存活的分类单元的相对丰度变化。浅灰色条表示相对丰度降低，深灰色条表示相对丰度升高。选定的细菌类群通过qPCR进一步评估（箭头）。仅描绘了相对丰度变化至少2·5倍的分类单元。

为了证实在分类单元相对丰度中观察到的变化，通过定量PCR确定了上面列出的受处理严重影响的分类单元的绝对水平。这包括对所有主要丁酸盐生产者的相对丰度进行≥2．5倍的评估，以及对那些总体流行率最高的分类单元（细菌／ Prevetolla和双歧杆菌属）的评估。与相同组的标准分析相比，厌氧处理组中活菌（经PMA处理）的相对细菌数量的变化在补充资料中显示。

靶向扩增活微生物

通过使用靶向定量PCR分析，可以确定属于特定细菌物种的活细胞的比例。用于测定F． prausnitzii，S．变量，A． hadrus，霍氏真杆菌，和罗斯氏／ E．直肠包括作为这些类群表明＞在相对丰度2．5倍或更大的下降以下在环境空气中处理。细菌杆菌／普氏杆菌的测定。和双歧杆菌属。由于这些是我们队列中相对丰度最高的属，因此也进行了研究。每种加工条件下各个供体的结果见补充表3a–c。

通过特定的qPCR分析确定为可行的细菌比例。通过将在PMA处理的样品中扩增的活细胞除以在未经PMA处理的对照样品中扩增的细胞总数来确定活细胞的比例。在新鲜厌氧条件，新鲜需氧条件下处理，在厌氧处理后的标本中冷冻和解冻一个周期（FT1）或在热杀死后（HK），评估粪便中的细菌生存力。箱形图描绘了中位数和IQR，误差棒描绘了来自8个单独供体的粪便样本的最小值至最大值。所有重要的比较均以星号表示（＝ p ＜0·05；＝ p ＜0·01；＝ p＜0·001；Wilcoxon配对配对签署等级测试）。

观察到对除了所有类群以下环境空气处理活细菌的水平显著减少罗斯氏／ E．直肠E（，观察其处理的无显著影响）。在F． prausnitzii的情况下，O 2组中活菌的比例与热灭活的等分试样没有显着差异。冷冻融化后，哈氏肠杆菌是唯一显示绝对生存水平显着降低的物种。

进行了大肠杆菌绝对丰度的评估，因为该分类单元显示了在环境空气中处理后相对丰度的最大增加。除一个人外，其他所有捐献者中大肠杆菌的绝对扩增均低于定量阈值，不同处理方法之间无显着差异（补充表3a－c）。阿利斯皮犬在环境空气中处理后也显示出相对丰度增加，但绝对丰度没有增加。

使用半定量PCR方法估算丁酸CoA：乙酸酯CoA转移酶基因（丁酸生物合成的主要途径中的末端酶）编码基因在活细菌细胞中的运输（这被用作替代方法）。丁酸酯的整体生物合成能力）。当比较在环境空气中处理的活细胞的扩增时，该酶的水平显着低于从厌氧处理的样品（p ？＝ 0．012）或冻融样品（p ？＝ 0．001）的活细胞中检测到的酶水平。在环境空气中处理的活细胞中检测到的丁酰辅酶A：乙酸酯辅酶A转移酶基因的水平相当于已被热杀死的样品。

在一轮冷冻和冷冻后，在新鲜厌氧条件下（ANO 2），新鲜需氧条件下（O 2）扩增人肠道菌群中丁酸中心合成途径的末端酶－丁酰－CoA：乙酸盐CoA－转移酶基因。在经过PMA处理的样品中，在厌氧处理的标本（FT1）中或在热杀死后（HK）解冻。相对于纯粪便浆液（FS对照）的10倍稀释系列中的扩增，测量了丁酰辅酶A（CoA）CoA转移酶基因水平。虚线代表测定的定量极限。箱形图描绘了中值和IQR，误差线描绘了来自8个个体供体的粪便样本的最小值至最大值。明显的比较用星号表示。（＝ p＜0·05； ＝p ＜0·01；＝ p ＜0·001；Wilcoxon配对配对签署等级测试）。

SCFA生物合成

后发酵SCFA水平的成对比较表明微生物butyrogenic和产乙酸容量时供体粪便是在环境空气（经处理的O操作被显著减少2 VS ANO 2，p ＝ 0．008和p ？＝ 0．016分别图6）。相比之下，丙酸生物合成的显着变化与氧气暴露无关。

用高直链玉米玉米淀粉对粪菌移植粪便进行体外发酵后，丁酸和醋酸盐的净产量。匹配的样品（n ＝ 8）在厌氧条件下（ANO 2）或在有氧条件下（O 2）处理。明显的比较用星号表示。（＝ p ＜0·05； ＝ p ＜0·01； Wilcoxon匹配对有符号秩检验）。

目前，没有什么证据可以指导临床医生使用粪菌移植如何最好地确保在粪便移植材料中保留供体微生物的生存能力。供体材料中微生物群的分析不是常规操作，执行时，所用方法无法评估生存力。基于PMA的方法能够克服评估粪便中精炼细菌复杂群体生存能力的许多挑战。然而，PMA方法的主要局限性在于它容易高估样品中活细菌的数量。这意味着存活细胞的数量可能少于我们报告的数量。此外，对PMA处理所需的标本进行稀释意味着将非常稀有的类群排除在这种类型的分析之外。
尽管存在这些局限性，但我们表明，报告粪菌移植材料中存在的微生物群的当前方法明显高估了移植的活细菌的数量。平均而言，在严格的厌氧条件下立即处理后，在我们的研究中，粪便移植物中只有一半的细菌仍然可以存活。PMA样品处理的使用还表明，这些移植物中细菌的多样性明显少于使用标准测序方法所报道的细菌多样性。

我们观察到供体间的实质性差异对样品处理的影响。可以通过微生物组组成的个体差异来解释这种差异，从而导致微生物群落对氧气的暴露和冻结具有不同的脆弱性，并表明需要对所有供体材料进行活力评估。

我们的研究表明，通过在环境空气中混合粪便而使其均质化对其生存细菌组成产生深远影响。在大多数临床试验中，环境空气处理是默认操作，在美国，英国和欧洲共识性指南中都有描述，尽管在许多规程中，粪便是手动均质的，没有像本研究那样混合。与手动均质化相比，在高速混合过程中产生的增加的空气流量可能会导致氧气暴露增加，并且对氧气敏感物种更加有害。

受氧暴露影响最大的专性厌氧肠共生种，是丁酸生物合成的主要贡献者，包括费氏杆菌，变数亚种，真细菌，哈里氏杆菌和厌氧厌食菌。丁酸盐是一种由肠道菌群发酵产生的短链脂肪酸。除了是结肠的，丁酸盐的主要能量源，并具有二者的抗炎和抗致癌特性。降低的腔内丁酸酯浓度或丁酸酯利用率与肠细胞三磷酸腺苷的消耗，紧密连接的丧失，粘液产生减少以及由此产生的结肠屏障破坏有关，具有炎症和免疫学后果。

我们观察到在大多数供体中可行的F． prausnitzii和A． hadrus的比例，以及丁酰辅酶A：乙酸酯辅酶A转移酶基因的水平降低到在热灭活的标本中检测到的水平。在氧气存在下进行处理。肠道内产生丁酸盐的细菌，特别是F． prausnitzii的相对减少与多种慢性疾病的存在有关，包括抑郁症，肥胖症，2型糖尿病和炎症性肠病疾病。这些发现表明，在环境空气中处理粪便可能会对使用粪菌移植实现抗炎或免疫调节结果的努力产生负面影响。

双歧杆菌属和拟杆菌属分别是短链脂肪酸的主要生产者，乙酸盐和丙酸盐，并且像丁酸盐一样是重要的能量和信号分子。尽管它们的有益作用还不如丁酸酯，但这些代谢物还是重要的免疫和代谢调节剂。暴露于氧气后，这些属的成员的丰度也显着降低。但是，仍然存在大量的剩余存活种群，特别是在拟杆菌属的情况下。表明接受者的内脏可能会再次扩张。

尽管冷冻确实会降低移植材料的整体生存能力（将整体生存能力降低至约25％），但可行的微生物群组成与经过厌氧处理的新鲜标本没有显着差异。在冷冻融化的标本中，仅发现一种细菌，即哈氏真细菌（Eubacterium hallii）显着减少。尽管哈氏肠杆菌是主要的丁酸酯生产者，但该功能也由其他几种细菌执行。该单一物种丧失的潜在临床意义尚不确定。

除了通过在环境空气中处理而使粪便中的有益共生细菌耗竭之外，潜在致病物种（例如大肠杆菌和其他耐氧革兰氏阴性细菌）的相对丰度也会成比例增加。在我们的供者队列中，大肠杆菌水平新鲜粪便含量非常低，没有证据表明加工过程中绝对丰度增加。但是，样品处理的延迟会导致在室温下延长时间，这可能会导致大量机会病原体大量增加。丁酸产生厌氧菌具有耐氧物种的过度生长合并的损失可能会从健康供体的变换粪便移植材料进入粪便材料与微生物群分布更紧密地类似于那些与炎性肠病，2型糖尿病和大肠癌。

在厌氧室内处理粪菌移植材料可实现重要共生物种的最佳保存。在艰难梭菌的背景下结肠炎，好氧处理似乎不会对临床结果产生不利影响。但是，在对粪菌移植进行其他适应症的调查时，应该尝试最佳保存共生菌，而尚不清楚共生厌氧菌的损失如何影响临床结果。我们研究的局限性在于没有分析加工延迟的影响。尽管在这项研究中粪便标本在15分钟内进行了处理，但这在大多数临床环境中是无法实现的，并且延迟几个小时的处理更为典型。这种处理上的延迟可能导致活菌群组成的改变。先前许多采用分子策略的研究都报告，粪便分析的延迟与微生物群组成和生存力的变化有关等人评估了最多7个小时的增量时间延迟后，一位供体中粪菌移植材料的变化，并观察到了这段时间内微生物组组成发生变化的趋势。这些报告得到了许多基于文化的研究的支持，这些研究表明，当处理延迟时，特别是在室温下，并且样品没有在厌氧条件下存储时，厌氧菌的回收率会降低。在进一步研究澄清影响或处理延迟之前，我们建议样品收集和处理之间的时间越短越好。

处理后，粪便应立即在－80°C下冷冻。在滴注之前将样品冷冻的能力很重要，因为它为完成包括病毒和寄生虫在内的病原体的系统测试提供了机会。冷冻还可以根据需要提供大便，以用于紧急临床情况。我们的分析表明，尽管冻融确实会影响粪便的存活组成，但总体而言，这种作用相对有限。但是，各个供体微生物群对冻结的反应存在差异。在这项研究中，两个供体的总体细菌生存力下降到单独冷冻融化后环境空气处理后的水平以下。

在粪菌移植临床试验的设计中，粪便加工在改变粪便移植物成分方面所起的作用已被广泛忽略。坚持严格的厌氧粪便处理协议可能会导致在某些临床情况下粪菌移植的收益增加。其他因素，例如粪便处理和储存条件的延迟，可能对细菌生存力的影响与厌氧处理一样大，但在本研究中未进行评估。用生存力测定法评估供体移植材料的组成，以确保微生物群组成包括范围广泛的活菌，其中一些对介导粪菌移植的治疗作用可能至关重要，这对将来的试验将是有益的。