可视化DNA损伤分析新技术揭示：氧化性DNA损伤在异染色质和常染色质中的修复方式是不同的

文章背景简介

细胞呼吸、感染过程及化学、物理因子均可产生活性氧（ROS）。ROS会诱导DNA的碱基氧化及单链断裂（SSBs），这种DNA损伤可被碱基切除／单链断裂方式修复（BER／SSBR）。假如不修复，ROS诱导的损伤就会阻碍DNA复制和转录，导致基因组不稳定，从而产生突变，进而驱动肿瘤发生。BER和SSBR均通过DNA聚合酶修复形成长片段或短片段，在DNA连接酶III或DNA连接酶Ⅰ的作用下进行连接。

在活细胞中，ROS诱导的DNA损伤可在时间和空间范围内进行修复，而染色质结构对于DNA修复过程是至关重要的。利用含有旋转定位尿嘧啶的重组核小体进行的体外研究表明在染色质损伤的情况下，BER酶的催化活性会受到抑制，ATP酶染色质重构因子SWI／SNF对8－oxoG BER的去除作用非常弱，说明染色质重构会促进BER。

2013年，匹兹堡大学的Li Lan等人在《Nucleic Acids Research》（IF＝11．561，生物1区）发表了题为“Novel method for site－specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin”的文章。本文使用特异性的荧光蛋白KillerRed （KR），在活细胞的特定基因位置产生ROS诱导的氧化损伤。利用这种基于活化KR生成ROS的潜在机制，研究开发了一个可视化实验系统，通过将tetR－KR或TA－KR定位表达在人类细胞中特定的常染色质或异染色质位点上，从而可以实时观察BER酶在特定位点的募集情况。

所用到的主要方法

1、荧光原位杂交；

2、染色质免疫共沉淀；

3、乙炔基尿苷渗入检测RNA合成；

4、流式细胞术；

5、KR 激活；

6、细胞存活（MTT和菌落形成测定）

文章主要内容摘要

活性氧（ROS）诱导的DNA损伤可以通过碱基切除修复途径进行修复。但染色质结构对损伤位点BER蛋白的募集影响尚不清楚。为了解决这个问题，本研究开发了一种新方法，将光刺激产生ROS的诱导因子KillerRed （KR）与tet－阻遏因子（tetR－KR）或转录激活因子（TA－KR）融合，特异性地产生ROS，诱导DNA损伤。在U2OS细胞中，TetR－KR或TA－KR分别与90kb的TRE结合，整合在特定的基因组位点，诱导异染色质或常染色质中ROS的损伤。研究发现在异染色质和常染色质中，DNA糖苷酶可有效地募集到DNA损伤位点，PARP1则更有效募集到浓缩染色质中，相反，FEN1募集到活性染色质的DNA损伤位点，并且以PCNA－和转录激活依赖的方式高度富集。这些结果表明，氧化性DNA损伤在异染色质或常染色质中的修复方式是不同的。