酵母中反式DNA末端连接频率不受双链断裂预损伤空间邻近性的影响

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文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

双链断裂（DSBs）是一种严重的染色体损伤，可导致基因组不稳定。真核细胞主要通过同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两种机制来修复DSBs。从酵母到人类，每一种都是高度保守的。HR需要一个同源模板来实现修复，而NHEJ则执行两个DSB端直接连接。通常来说，相同的DSB末端连接在一起我们称之为顺式修复（cis）；两个不同的DSB末端异常连接在一起，我们称之为反式修复（trans）。反式修复会导致染色体的重排，包括易位、倒转、缺失、插入和重复。对大多数自发重排的联合分析揭示了连接处的微同源性，表明它们通常是NHEJ的结果。然而，阻止或促进具有多个DSB的细胞核中反式重排的因素却知之甚少。

重要的是，顺式和反式修复在DSBs都代表真正的DNA修复。因此，类似依赖rad52的机制可以同时进行同源重组和异位重组。依赖于Ku家族 DSB结合蛋白和DNA连接酶IV（酵母中的Dnl4）的共同机制可以催化顺式和反式NHEJ事件。依赖于DSB的诱变可能取决于细胞核中病变的空间分布，特别是不同位置的DSB是否同样可能使其末端连接。Lisby等研究表明，在形成多个DSB后，在酿酒酵母中仅观察到两个Rad52病灶，表明每个病灶都聚集了不止一个DSB进行修复。 这说明DSB倾向于聚集，即聚集在一起进行修复。 在内切核酸酶诱导后或在将细胞暴露于电离辐射后，哺乳动物细胞中也报道了DSB的聚类。 有人认为DSB聚类是有利的，并不局限于接近的染色体结构域，因此空间临近性不足以解释DSB聚类。

美国密歇根大学的Sham Sunder和Thomas E．Wilson，2019年在《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》（IF 9．504，生物2区）发表题为“Frequency of DNA end joining in trans is not determined by the predamage spatial proximity of double－strand breaks in yeast”的研究。在这项工作中，作者们研究了同源DSB在酵母细胞核中的相对位置如何影响反式DSB修复频率。 本研究主要专注于精确的NHEJ以及类似MMEJ的SSA（single strand annealing）事件。 在形成多个DSB之后，顺式修复优于反式修复，但反式修复效率与所报道的核内DSB位点的预损伤空间邻近性显著无关。这些发现与DSB的固定化和可能的区域化修复是一致的。这些发现与DSB被聚集并可能被分割以进行修复是一致的。

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所用到的主要方法

METHODS

1．基因组重排测定NHEJ、SSA和HR修复实验。

2．竞争实验

3．接触频率的计算

4． DSB修复结果分析

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

DNA双链断裂（DSBs）是严重的基因组损伤，如果错误修复会导致染色体的重排。为了深入了解促成这些重排的核机制，本研究在酵母中开发了一种对于大多数精密的非同源末端连接（NHEJ）的测定修复的方法，包括顺式（相同位点）和反式（不同位点）的修复。在测定中，HO内切酶基因置于两个HO切割位点之间，这样在诱导HO内切酶表达后可以自我终止。进一步在不同的基因组位点上放置了一个额外的剪切位点，这样反式修复可导致LEU2报告基因的表达。与之前的研究一致，顺式NHEJ比反式NHEJ更有效。然而，与同源重组不同，单个DSB与供体基因座之间的空间距离与修复效率相关；而无论两个DSB基因座的位置如何，即使当两个反式修复具有竞争关系时，反式NHEJ频率基本保持不变。通过短的直接重复序列经单链退火修复（SSA）类似的DSBs，修复效率和反式修复频率都显著提高，但仍然没有反式修复与基因组位置的强相关性。本研究结果表明多个DSB修复不受预损伤空间临近性的影响。

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