小药谈肿瘤免疫之neuronilin-1

前言

免疫检查点抑制剂的出现在肿瘤免疫治疗领域取得了巨大的成功，但大多数患者仍然未能获得理想的临床反应。人们提出了许多关于免疫治疗抵抗的解释，包括低抑制性受体（IR）配体表达，新表位的低免疫原性，高肿瘤负荷与炎症反应比以及免疫排斥等。

检查点阻断疗法的广泛作用机制是通过IRs逆转固有的T细胞抑制。这些药物干扰了肿瘤微环境（TME）中CD8＋T细胞表达的IRs与相应配体的结合，从而促进了效应T细胞细胞因子的产生和T细胞对刺激的反应增殖。另一方面，IR阻断对TME中免疫抑制细胞（尤其是Treg细胞）功能的细胞内在影响值得进一步研究。尽管CTLA－4、TIGIT、和TIM标记了更多抑制性的Treg细胞，但PD1和LAG3的作用是模棱两可的，并且可能与具体情况有关。最近的一篇论文表明，抗PD1治疗可使治疗中进展过度的患者体内的PD1＋Treg细胞恢复活力。因此，对于该领域来说，检查点阻断如何协调促进CD8＋T细胞激活和加强Treg细胞抑制之间的平衡是至关重要的。

近年来，神经纤毛蛋白－1（neuronilin－1，NRP1）因其强大的双重功能：增强Treg细胞抑制和限制CD8＋T细胞的持久反应，在免疫肿瘤学领域引起了广泛的关注。尽管最初被认为是一种Treg细胞标志物，新的研究表明NRP1不仅对TME中固有的Treg细胞稳定性是必需的，而且它还显著地抑制CD8＋T细胞的抗肿瘤功能。另外，它在髓系细胞亚群中也高度表达，但其在这方面的功能不太明确。已有的临床前结果进一步证明NRP1拮抗作用与已建立的免疫疗法相结合的可行性。NRP1在TME中作为一个关键的免疫调节剂具有诱人的开发前景。

NRP1的基础生物学

神经纤毛蛋白（neuronilins，NRPs）是一种单次跨膜、非酪氨酸激酶表面糖蛋白，在所有脊椎动物中都存在，在物种间高度保守。已知存在两种同源的NRP亚型，即NRP1和NRP2，由不同的基因编码，这两种NRP最初被发现为神经元粘附分子。后来发现它们与血管生物学有关，正常胚胎血管发育需要NRP1和NRP2参与小淋巴管和毛细血管的形成。过去10年的研究表明，NRP是一种多功能蛋白质，参与除神经和血管发育以外的多种生物过程，其中NRP1起在免疫和肿瘤发生中起主要作用。

NRP1蛋白由一个长的N端胞外结构域组成，接着是一个跨膜区和一个由43－44个氨基酸组成的非常短的胞内区。细胞外结构域由三个主要片段组成，即两个CUB（补体C1r／C1s，Uegf，骨形态发生蛋白1）结构域（表示为a1／a2）和两个凝血因子V／VIII结构域（表示为FV／VIII或b1／b2），然后是MAM（与meprin蛋白酶同源，A5抗原，受体酪氨酸磷酸酶μ和К）结构域（表示为“c”）。CUB结构域是连接信号素配基所必需的，而FV／VIII结构域负责血管内皮生长因子（VEGF）的结合以及不同配体（如信号素和VEGF）的对接位点。已知MAM结构域介导受体的同源二聚或异源二聚。尽管最初人们认为NRP1是一个非信号受体，因为它的胞内区很短，但后来发现c端保守的PDZ（PSD－95／Dlg／ZO－1同源性）结构域结合基序（SEA）与GAIP相互作用蛋白c－末端／synectin结合，后者介导细胞内信号传递和受体内化。

NRP1能够与广泛的配体结合，解释了其多样的生物学功能。NRP1首先被确定为分泌的III类信号素的共同受体，如信号素3A（Sema3A），后来发现NRP1与多种生长因子结合，最显著的是VEGF1，以及其他包括转化生长因子β、血小板衍生生长因子C和D、和C－Met。有趣的是，最近的研究表明，NRP1还与细胞外microRNA／AGO2复合物结合并促进其内部化，增加了NRP1调节细胞功能的另一种机制。

免疫系统中的NRP1

髓系细胞

NRP1在人类和小鼠的中枢神经和血管系统中广泛表达于多种组织和细胞中，而NRP1在免疫系统中的表达受到更多的限制和调节。NRP1被鉴定为人类树突状细胞（DC）的标志物，称为血液DC抗原4（BDCA4，或CD304），在所有浆细胞样DC（pDCs）中均有表达。pDCs被称为“专业的”I型干扰素（IFN）产生细胞型，当用抗NRP1抗体治疗时，显示人类pDCs病毒感染时IFN－α释放减少，提示NRP1在抗病毒免疫中具有免疫调节作用。其他表达NRP1的抗原呈递细胞（APC）包括单核细胞和巨噬细胞，尤其是几种组织内的巨噬细胞，例如小胶质细胞和脂肪组织巨噬细胞（ATM）。单核细胞／巨噬细胞NRP1的表达通常被认为是促血管生成和抗炎的，因此有助于组织重塑和伤口愈合。在最近的一份报告中，发现NRP1＋ATM可通过维持葡萄糖动态平衡来预防肥胖和代谢综合征。

T细胞

在适应性免疫中，NRP1被认为是小鼠胸腺源性Treg（tTreg）细胞的标记物，尽管这并不适用于人类Treg细胞。相反，NRP1在静止的CD4＋辅助性T细胞和CD8＋T细胞上表达非常低。在抵抗实验性自身免疫性脑炎（EAE）的小鼠模型中，NRP1在EAE耐受性CD4＋T细胞（同时在Foxp3＋和Foxp3－）中上调，并在功能上促成其抑制表型。其他报告有NRP1表达的T细胞亚群包括T滤泡辅助细胞和IL－17表达的不变自然杀伤性T细胞。最后，NRP1在人类胸腺上皮细胞（TEC）上结构性表达，在TEC与胸腺细胞接触期间上调未成熟胸腺细胞，随后被Sema3A阻断以引导胸腺细胞迁移。

髓系细胞－T细胞相互作用

NRP1也由从人类外周血中分离出来的传统树突状细胞表达，它可能通过同型相互作用介导树突状细胞和T细胞之间免疫突触的形成来促进早期T细胞启动。由于Treg细胞优先表达NRP1，在没有炎症或外来抗原暴露的情况下，Treg细胞通过NRP1–NRP1相互作用使DC在免疫突触上的作用时间更长，这是一种维持免疫耐受处于稳态的机制。此外，在移植的情况下，细胞膜蛋白从APCs转移到T细胞，称为trogocytosis，通过几种已知的NRP1配体（如Sema3A和VEGF）使CD4＋T细胞对抑制信号敏感。此外，VEGF作为一种免疫抑制细胞因子，可以以NRP1依赖的方式抑制脂多糖诱导的DC成熟。

总之，很明显，NRP1介导重要的免疫调节功能，包括自我耐受和免疫稳态，类似于一些已知的IRs的活性。然而，NRP1与经典IRs的区别在于，它对多种细胞类型，特别是免疫抑制细胞产生这样的影响。这些特征强调了为什么在癌症的背景下检查NRP1的功能可能是改进免疫治疗的关键步骤。

NRP1在小鼠和人TME中的表达和功能

NRP1与癌症之间已建立的联系得到了三个关键的观察结果的支持：（1）NRP1在多种人类癌症类型的恶性细胞中高表达；（2）NRP1在TME中大量表达，包括基质细胞和免疫细胞；（3）NRP1的表达通常与不良的临床预后相关。从肿瘤细胞的角度来看，NRP1通过多种功能支持肿瘤细胞的生长，包括细胞存活、新生血管生成和转移。

在肿瘤－免疫界面，NRP1通过在TME的免疫室中协调多种抑制过程来促进免疫逃避。一方面，NRP1在树突状细胞和巨噬细胞中的生理作用，有助于这些细胞的抗炎表型，被肿瘤“劫持”以促进肿瘤血管生成和肿瘤相关免疫抑制。另一方面，NRP1直接影响适应性抗肿瘤免疫，这是通过调节肿瘤内Treg细胞和CD8＋T细胞的细胞外和细胞内抑制途径来实现的。

Tregs细胞中的NRP1：稳定性的守护者

NRP1在人体组织和免疫细胞亚群中的表达反映了在小鼠模型中的发现。最显著的例外是Treg细胞。NRP1最初被认为是小鼠tTreg细胞的标记物，部分原因是它与Helios明显共表达。事实上，小鼠Nrp1基因是Foxp3介导的转录调控的直接靶点，异位表达和染色质免疫沉淀实验证明了这一点。随后的研究表明，NRP1在血液或淋巴结中的人类外周Treg细胞上不表达。相反，健康的供体Treg细胞在体外激活时上调NRP1，表明免疫过程可能在体内调节了NRP1的表达。尽管NRP1调控可能具有物种特异性的决定因素，但下面讨论的结果表明其对Treg细胞表型和功能的影响仍然是保守的。

在癌症的情况下，NRP1的Treg细胞表达通过至少两个平行的途径增强免疫抑制：通过充当VEGF的共受体促进Treg细胞向肿瘤募集，以及通过信号素－4A（Sema4a）维持肿瘤特异性Treg细胞的稳定性。在Cd4CreNrp1L／L的NRP1敲除的小鼠肿瘤模型中，尽管大量Nrp1缺陷的Treg细胞在体外具有相同的抑制功能，但肿瘤内CD8＋T细胞的比例和功能显著增加。这导致在植入式和自发性肿瘤模型中提高了无瘤生存率并减缓肿瘤生长。由于NRP1在血管生成中起到VEGFR2共受体的作用，研究表明NRP1＋Treg细胞在体外沿着VEGF梯度迁移。此外，在野生型小鼠中，通过皮下注射Vegf–／–纤维肉瘤肿瘤，与Vegf＋的肿瘤相比，在野生型小鼠体内肿瘤生长的减少可以重现。这些观察结果强调了在肿瘤模型中，作为Treg细胞建立免疫抑制的关键成分，VEGF对Treg细胞的趋化反应的重要性。

此外，除了细胞迁移外，NRP1对维持肿瘤内Treg细胞功能和表型至关重要。通过抗体阻断或Treg细胞特异性基因缺失（通过Foxp3CreNrp1L／L）破坏NRP1通路，阻碍了肿瘤内Treg细胞抑制功能，从而恢复了抗肿瘤免疫，而避免了自身免疫的外周脱靶效应。与Nrp1＋／＋野生型相比，Nrp1–／–肿瘤内Treg细胞的Bcl2降低，活性caspase－3增加，表明生存路径的失调。此外，Nrp1–／–瘤内Treg细胞下调激活标记物（包括Helios、IL－10、ICOS、CD73）而出现特征性T辅助细胞系标记物（如Tbet、CXCR3、IRF－4和RORγT）。研究表明，NRP1定位于T细胞活化过程中的免疫突触，通过磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）抑制Akt（又称蛋白激酶B或PKB）活性，从而减轻Akt介导的对Foxo1／3的拮抗作用，稳定Treg细胞功能。后续研究表明，虽然肿瘤内Nrp1缺陷的Treg细胞保留了Foxp3的表达，但出现促炎性表型和IFN－γ的增加，表明其抑制功能的丧失。有趣的是，Nrp1–／–Treg细胞产生IFNγ会引起邻近Nrp1＋Treg细胞功能紊乱。在MC38肿瘤模型中，为了调节抗PD1的免疫治疗，需要Treg细胞增加对IFNγ的敏感性来达到肿瘤清除的目的。事实上，携带缺乏IFN－γ受体的Treg细胞的小鼠对抗PD1不敏感。这些发现为进一步研究NRP1作为治疗药物的拮抗作用提供了重要的临床依据。

许多研究报告了癌症患者的NRP1＋Treg细胞增多。这种Treg细胞表型在胰腺癌和结直肠癌肝转移的外周血中也有报道。在慢性淋巴细胞白血病中，在患者血液中观察到B细胞和Treg细胞上NRP1升高，在沙利度胺治疗后减少。还有报道称，在宫颈癌患者的肿瘤引流淋巴结（TDLN）中，NRP1＋Treg细胞增多，尤其是肿瘤转移的TDLN。此外，人NRP1＋Treg细胞的功能更为抑制，FOXP3和糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（GITR）在NRP1＋Treg细胞中的表达增加。有趣的是，针对VEGF结合域的NRP1拮抗剂通过诱导NRP1蛋白内化，使人肿瘤内Treg细胞抑制降低约20％。最后，还有研究报告了外周血中NRP1＋Treg细胞的升高，原发性黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌患者的肿瘤中NRP1＋Treg细胞的比率与无病生存率呈负相关。这些发现共同支持了NRP1＋Treg细胞在癌症中功能增强的观点。此外，在癌症患者外周血中观察到NRP1＋Treg细胞的增加。这一发现在IRs中是唯一的，它们在血液样本中的表达往往很低，可能表明循环Treg细胞上的NRP1表达可作为临床结果的预处理或治疗预后生物标志物。