肿瘤免疫微环境生物标志物与免疫治疗反应

在过去的十年里，免疫疗法的出现确实彻底改变了癌症治疗的模式。许多靶向程序性细胞死亡蛋白－1（PD－1）或其配体（PD－L1）的治疗药物已被监管机构批准作为单一治疗药物，或与化疗和其他靶向药物联合使用。在临床研究中，PD－L1免疫组织化学（IHC）和肿瘤突变负荷（TMB）是迄今为止发现的主要预测性生物标记物，然而，PD－L1 IHC仍然是临床实践中用于告知免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的主要辅助诊断试验。

PD－L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞表面表达，在多种肿瘤类型的研究已经确定了PD－L1水平与单药抗PD－1／PD－L1治疗的临床益处之间的关联。虽然PD－L1高表达的患者通常能获得最大的临床益处，但肿瘤低或无PD－L1表达的患者也依然能受益，这促使我们需要进一步探索不断进化的癌症基因组变化与浸润性免疫细胞亚型之间的因果关系。

考虑到PD－L1作为单一生物标记物的局限性，我们需要了解复杂的肿瘤微环境（TME），以开发更好的生物标记物和诊断方法，更准确地预测临床效益，至关重要的是，更有针对性地对肿瘤产生有效的免疫反应。

预测性生物标志物

PD－L1 IHC

与突变的二元性不同，PD－L1是一种线性生物标记物，因此可以在多个表达阈值下进行评估。由于肿瘤细胞和免疫细胞上PD－L1表达的复杂生物学特性，已批准的PD－L1 IHC分析不仅采用不同的表达阈值，而且采用不同的评分方法。PD－L1评分算法具有分析特异性、适应症依赖性，并且根据治疗路线而变化。有些检测仅对肿瘤细胞表达进行评分（忽略免疫细胞），而有些检测仅对免疫细胞的PD－L1进行评估（忽略肿瘤细胞），其它检测则对肿瘤和免疫细胞的PD－L1同时进行测量。下表显示了非小细胞肺癌（NSCLC）中使用的主要PD－L1 IHC分析的截止值。需要注意的是，这些经验证的截止值的批准和用途是特定于国家的。

PD－L1的表达是动态的，在肿瘤类型、肿瘤部位，甚至在同一肿瘤标本中表现出显著差异。肿瘤细胞中PD－L1的表达受基因组、表观遗传学和转录机制的调控。肿瘤细胞上的PD－L1与NSCLC中CD8＋T细胞浸润程度之间的强相关性很可能是由于对炎症信号（如IFN－γ）反应中的转录调节，这些炎症信号是由活跃的抗肿瘤免疫反应产生的。

PD－L1的非均匀表达（通常局限于免疫浸润区域）表明，由于TME内相关细胞因子的高局部浓度，PD－L1被适应性诱导，并进一步突出了肿瘤内的异质性。PD－L1的肿瘤内异质性和可塑性可能会影响患者的管理决策，此外，由于采样可能会产生假阴性得PD－L1 IHC结果。活检的位置和已进行过的治疗是PD－L1表达的重要参数。由于临床原因，在治疗开始时获得新的活检可能不可行，但由于免疫反应的可塑性，尤其是PD－L1，存档肿瘤标本不一定反映复发或转移性病变中的TME。

多种免疫细胞类型，主要是巨噬细胞、树突状细胞（DC），以及T细胞、NK细胞和B细胞，可表达PD－L1。目前尚不清楚哪些特定免疫群体或免疫细胞的空间特征与临床最相关。需要使用多重IHC技术进一步描述肿瘤细胞与特定免疫细胞亚群的空间相互作用，以确定是否需要继续将免疫细胞分类为一个更广泛的类别，这需要更细致、更复杂的分析。

其它生物标志物

临床试验表明，具有大量效应T细胞的肿瘤对ICI治疗更为敏感。有研究使用以IFN－γ为中心的基因表达特征来显示使用抗PD－1抗体pembrolizumab治疗的黑色素瘤患者的总体应答率（ORR）和无进展生存率（PFS）的相关性。与这些发现一致，在NSCLC中进行的IMpower150试验报告了一种T效应细胞（Teff）基因表达特征，由PD－L1、CXCL9和IFN－γ组成，当比较atezolizumab联合化疗比较单独化疗时，该特征对PFS有益。

此外，具有高突变负荷的肿瘤患者从CI治疗中获得了更大的临床益处。TMB和PD－L1 IHC的一致性研究似乎表明，这些生物标记物是正交的，并独立预测CI治疗的益处。因此，pembrolizumab最近获得了监管部门的批准，用于治疗先前治疗后有进展且无替代治疗方案的不可切除或转移性高TMB实体瘤。

随着对更具预测性的生物标志物的研究不断深入，有必要摆脱单一分析方法，整合负责进行免疫反应的各种生物过程。初步的探索性分析表明，联合生物标志物可以转化为临床益处。在Checkmate－026和Checkmate－227研究中，肿瘤表达高水平PD－L1并具有高组织TMB状态的患者从抗PD－1抗体nivolumab治疗中获得最大益处。OAK研究也报告了类似的结果。

免疫效应细胞的表型多样性

许多研究已经描述了肿瘤浸润淋巴细胞及其空间分布与治疗效益之间的关系。识别各种免疫效应细胞的空间分布需要通过功能分析来补充，如激活标记物和抗原反应性，通过分析肿瘤样本中CD8＋T细胞TCR序列的内在抗肿瘤反应性，表明识别自体肿瘤的能力仅限于少数肿瘤浸润CD8＋T细胞。更复杂的是，肿瘤不同区域（中心与边缘浸润）的CD4＋和CD8＋T细胞群中可能存在显著的TCR异质性，异质性的程度具有预后意义。

通常，三种不同的CD8＋T细胞群体可根据共同的转录谱识别：

表达CC－趋化因子受体7（CCR7）和转录因子7（TCF7）的原始或记忆细胞；

穿孔素1（PRF1）、颗粒酶A（GZMA）和GZMB阳性的细胞毒性细胞；以及

“功能失调”的多样性细胞群体，其特征是与耗竭状态相关的标记物，如PD－1（PDCD1）、LAG3和TIM3（HAVCR2）。

这三个群体的相对比例似乎高度可变，不仅在不同的肿瘤类型中如此，在相同组织学的肿瘤中也是如此。转录谱和TCR测序信息已被用于确定肿瘤内CD8＋细胞表型是否发生改变。初步模型表明，TME诱导的表型异质性功能失调细胞群从幼稚的CD8＋细胞进化而来，而后者以不依赖TME的方式产生细胞毒性细胞。“功能失调”细胞库中的细胞在多大程度上可以转化为“细胞毒性”状态目前尚不清楚，然而，了解这一点对于设计促进和触发这种转变的疗法非常重要。

此外，在几项研究中已经鉴定出对肿瘤表达的新抗原具有特异性的肿瘤内CD8＋T细胞，但其只是表型异质性总群体的一小部分。有趣的是，CD39似乎能够区分肿瘤特异性（高CD39）和旁观者（低CD39）CD8＋T细胞。其他表型和功能分析显示，CD39＋亚群共表达CD103以及PD－1、TIM3和CTLA－4，这些标记通常与耗竭状态相关。CD39和CD103的共同表达依赖于通过TCR的长时间刺激和TGF－β的暴露。有趣的是，高水平的CD39＋CD103＋双阳性细胞似乎转化为鳞状细胞头颈癌患者的生存益处。

免疫效应细胞的空间分布

最新的研究分析了CD8＋T细胞和MHCII类表达细胞（最可能的抗原呈递细胞）之间的空间关系。在肾细胞癌患者中，TCF1＋／CD8＋T细胞优先共定位于MHC II类表达细胞的区域，而TCF1?／CD8＋细胞在整个肿瘤中呈弥散分布。TCF1＋／CD8＋细胞的发生率也与DC的发生率相关，而TCF1?／CD8＋细胞没有表现出这种相关性。有趣的是，含有TCF1＋／CD8＋T细胞和表达MHC II类APC高密度区域的肿瘤具有更好的临床疗效，APC密集区可能为干细胞样CD8＋T细胞分化为能够维持抗肿瘤免疫反应的效应细胞提供了肿瘤内环境。

很明显，成熟、活跃的树突状细胞向肿瘤床的肿瘤浸润增加了免疫激活和活性免疫效应细胞的募集。准确识别和量化DCs具有重要价值，然而，标记物如CD11c、CD11b、CD163和MHC－II不是DC特异性的，并且在其他细胞类型如巨噬细胞上表达。DC可以促进或抑制新生免疫反应的观察结果进一步增加了复杂性，因为目前还没有有效的标记来区分两种DC状态。

在肿瘤进展过程中，TME转变为一种主动保护肿瘤细胞免受免疫攻击的环境，被认为具有肿瘤保护功能的TME细胞包括T调节细胞（Treg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和髓系抑制细胞（MDSCs）。

肿瘤保护作用通常通过分泌的细胞因子和趋化因子介导，这些细胞因子和趋化因子可防止免疫效应T细胞侵入肿瘤床或使这些细胞功能失效，例如，TGF－β。TGB－β抑制剂和抗PD－L1抗体的联合治疗可导致Teff的肿瘤内渗透，将表型从“排除”改变为“炎性”，减少转移并提高长期生存率。

MDSC是中性粒细胞和单核细胞样髓样细胞的异质群体，越来越多地被认为是各种癌症免疫抑制的关键介质。在癌症患者中，循环MDSC数量的增加与晚期临床分期、转移性疾病发病率的增加和免疫抑制相关。除了免疫抑制功能外，MDSC还可以通过与肿瘤细胞和周围基质的复杂串扰积极塑造肿瘤微环境，从而增加血管生成、肿瘤侵袭和转移。

肿瘤细胞的内在抗性

目前，我们对于肿瘤免疫治疗的不同反应和耐药机制的了解仍然有许多空白。虽然我们希望找到一颗灵丹妙药，但可能的事实是，有许多机制有助于产生抵抗。虽然肿瘤抑制因子（如p53）的突变增加了突变负荷，有助于放大新抗原的数量，并使肿瘤对免疫系统更敏感，但这些突变也可以驱动抗原呈递途径和关键细胞机制的突变，从而触发转录和代谢变化，进而对肿瘤浸润性免疫细胞产生间接影响。

肿瘤抗原呈递机制的一个关键组成部分是MHC I类分子，它由HLA I类（HLA－I）亚单位和β2微球蛋白（β2M）组成。MHC－I的下调存在于多种肿瘤类型中，可能通过多种机制发生，包括基因突变、表观遗传沉默、转录变化和翻译后修饰。

MHC－I的下调如何影响TME？研究发现，HLA－I阳性表达与免疫浸润密度相关，与PD－L1状态无关。所有HLA－I＋／PD－L1＋的肿瘤都有高度的CD8＋T细胞浸润，而HLA－I缺失与肿瘤内T淋巴细胞数量减少相关，其空间局限于肿瘤周围的基质。而HLA－I－／PD－L1－的肿瘤较大，CD8＋T细胞密度较低。这项研究表明，肿瘤免疫逃逸表型结合了两种独立的免疫逃逸机制：HLA－I的丢失和PD－L1的上调。

新辅助治疗中获得经验

最近对早期疾病免疫治疗的探索为了解TME及其在治疗反应中的变化提供了新的机会。新辅助研究特别丰富，因为治疗前经常收集诊断性活检，并可与新辅助治疗后立即进行的手术切除进行比较。

ABACUS试验是一项单臂2期研究，研究膀胱切除术前atezolizumab的新辅助治疗。升高的PD－L1水平（SP142；IC≥5％），基线Teff基因表达和上皮内CD8＋T细胞与临床益处相关。有趣的是，与术前相比，在治疗后肿瘤样本中观察到上皮内CD8＋T细胞和PD－L1＋免疫细胞的数量增加，并且这种增加在应答者中比在复发患者中更为明显。在治疗后样本中发现，TGF－β、成纤维细胞活化蛋白和细胞周期基因升高与耐药性相关。

PURE－01研究报告了类似的结果，膀胱上皮癌患者在根治性膀胱切除术前接受了三个周期的pembrolizumab。与PD－L1状态较低的患者相比，PD－L1 IHC升高的患者（22C3；CPS≥10％）获得了更高的病理完全缓解率。与治疗前活检相比，治疗后切除的PD－L1 CPS水平升高，TMB水平降低。此外，与治疗前样本相比，治疗后样本中的免疫相关基因（包括与IFN－γ信号、抗原呈递和T细胞功能相关的基因）也有所增加。

NABUCCO研究评估了III期尿路上皮癌切除术前使用ipilimumab和nivolumab的效果。与ABACUS和PURE－01研究相比，治疗结果与肿瘤内CD8＋T细胞浸润或Teff信号的基线状态无关。相反，研究观察到，在获得完全应答的患者中，TMB升高与DDR基因改变频率升高之间存在一种趋势。无法获得完全应答的患者在基线样本中富含TGF－β基因表达特征，表明可能存在耐药机制。此外，还研究了TIL密度与反应之间的相关性，有趣的是，基线TIL与疗效之间没有相关性，但在治疗后获得CR的患者中观察到TIL富集。

这些观察结果并非膀胱癌所独有。NEOSTAR试验评估了nivolumab或nivolumab加ipilimumab作为可手术NSCLC患者的新辅助治疗。获得影像学或主要病理学反应的患者总体上比基线肿瘤样本的PD－L1更高。与单独使用nivolumab治疗相比，nivolumab加ipilimumab治疗后TIL、组织驻留记忆T细胞、TEFF和效应记忆T细胞的频率更高。

总体来说，基线PD－L1似乎可以预测ICI的反应。TMB、TIL和DDR等作为生物标志物也似乎很有希望，但需要进一步评估和验证。治疗方案的差异以及患者群体的异质性可能导致不同试验结果的不一致。随着新辅助免疫治疗和化疗－免疫治疗联合方案获得监管部门的批准，识别经验证的生物标记物以预测免疫反应对于帮助作出治疗决定至关重要。

小结

随着从化疗向靶向治疗和免疫治疗的过渡不断发展，研究人员将采用更复杂的临床试验设计，如靶向治疗和免疫治疗的联合，不同CI药物的联合，并且更加关注生物标记物的设计，这些生物标记物对预测单药或多药治疗方案的反应或耐药性具有更高的敏感性。

未来，很可能需要多参数的方法来确定最有可能对ICI治疗有反应的患者，开发基于组织的强大复合技术非常重要。这有助于更准备地描述TME的特征，并分析肿瘤和效应免疫细胞之间以及效应细胞和APC之间的相互作用。相关标记物的表达谱可能提示效应细胞的激活、抑制或耗竭状态，并提示耐药机制。

参考文献：

1．Microenvironmental regulation of tumourimmunity and response to immunotherapy． J Pathol． 2021 Jul； 254（4）：374–383．